用總膠原蛋白分析法分析魚組織中的膠原蛋白
QuickZyme總膠原測(cè)定提供了一種簡(jiǎn)單快速的測(cè)定生物樣品中膠原數(shù)量的方法。本應(yīng)用說明為該檢測(cè)方法在魚類組織中的應(yīng)用提供了指導(dǎo)，并顯示了與HPLC的比較。
介紹
膠原蛋白是脊椎動(dòng)物體內(nèi)豐富的蛋白質(zhì)。在魚類（魚）中，膠原蛋白含量約占總蛋白的3%，明顯低于哺乳動(dòng)物（17%）。
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膠原蛋白的含量負(fù)責(zé)魚片的完整性和質(zhì)地。
魚類組織中羥基脯氨酸的含量與生境有關(guān)。生活在溫水中的魚類膠原體的羥脯氨酸水平高于冷水物種，而哺乳動(dòng)
物中的羥脯氨酸水平甚至更高。這些羥脯氨酸水平與該物種膠原蛋白的熔化溫度相關(guān)。
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魚膠原越來越多地用于取 代傳統(tǒng)的動(dòng)物膠原來制備食品、化妝品或藥用明膠。魚膠原蛋白沒有宗教反對(duì)，也沒有與瘋牛病相關(guān)的問題。
魚類組織中膠原蛋白的準(zhǔn)確分析對(duì)于食用魚類的質(zhì)量控制和優(yōu)化魚類養(yǎng)殖條件都具有重要意義。雖然膠原蛋白
是魚類組織中的主要成分，但它是一種難以純化和定量的分子。這部分是由于膠原分子通過不同類型的交聯(lián)形
成廣泛的網(wǎng)絡(luò)，使得膠原分子不溶性，難以提取。
市用膠原蛋白檢測(cè)的數(shù)量和類型是有限的。
一些可溶性膠原的分析存在，基于膠原分子沉淀染料天狼星紅。然而，這些分析方法似乎不太適用于組織中的膠原蛋白的分析。
廣泛使用的膠原蛋白測(cè)定方法是基于膠原蛋白水解為游離氨基酸，然后使用HPLC或比色法測(cè)定膠原蛋白特異性
羥脯安酸。然而，這些分析方法是費(fèi)力的，耗時(shí)的，并需要特殊的設(shè)備。為了克服這些缺點(diǎn)，我們最近開發(fā)了
QuickZyme總膠原蛋白檢測(cè)法，基于相同的酸水解和比色檢測(cè)原理，但更快，更容易，不需要特殊設(shè)備。
在這個(gè)應(yīng)用說明中，我們展示了該檢測(cè)方法的優(yōu)化，使其用于測(cè)量魚類組織中的膠原蛋白的能力。
圖1?？偰z原蛋白比色法測(cè)定原理
方法
冷凍羅非魚魚片在當(dāng)?shù)爻蝎@得，儲(chǔ)存在-20oC。在使用前，立即將魚片解凍，并在快速酶總膠原檢測(cè)試劑盒提
供的水解管中稱重約300毫克的組織片。
每300mg組織中加入1.0ml6M鹽酸，并將試管牢固閉合。然后，組織在95oC的溫度控制的熱塊中水解過夜。水解物
變得非常暗，并含有小的黑色顆粒。冷卻至室溫后，將水解管在13000xg下離心10min。部分顆粒不能沉淀出來。
小心地取出一部分上清液，盡可能避免轉(zhuǎn)移顆粒。在4M鹽酸中連續(xù)稀釋水解物，稀釋2-256倍。35微升的幾種水
解液稀釋液的樣品根據(jù)說明書進(jìn)行總膠原蛋白測(cè)定。
根據(jù)Bank等人的研究，我們也用HPLC方法對(duì)水解物進(jìn)行了分析。
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結(jié)果
水解魚組織的稀釋曲線在低稀釋時(shí)呈高度非線性，僅在16倍或以上的稀釋中發(fā)現(xiàn)與稀釋的反應(yīng)呈線性關(guān)系（圖2）
。這表明，水解物中含有在高濃度下干擾羥脯氨酸著色反應(yīng)的物質(zhì)。這種干擾在樣品相當(dāng)稀釋時(shí)消失。為了研究
測(cè)定的回收率，在不同的水解物稀釋液中加入固定數(shù)量的羥脯氨酸。低稀釋（稀釋2倍時(shí)10%）時(shí)羥脯氨酸的回收
率很差，但稀釋16倍或以上的溶液與稀釋呈線性關(guān)系。這與魚的水解物的結(jié)果非常一致。羥脯氨酸在稀釋16倍或
更高時(shí)的回收率約為120%。
圖2魚水解物稀釋對(duì)總膠原蛋白測(cè)定反應(yīng)的影響。藍(lán)線：魚水 解物，紅線：魚水解物中加入150µM羥脯氨酸(Hyp)。上面板2 至256倍稀釋，下面板16至256倍稀釋。從16倍稀釋向下觀察到 與稀釋呈線性關(guān)系
快速酶總膠原蛋白檢測(cè)與HPLC的比較
根據(jù)Bank等人的方法，也用HPLC分析了用于比色總膠原蛋白法測(cè)定的相同水解物
4.
簡(jiǎn)而言之：水解物通過在快速 mac真空離心機(jī)中蒸發(fā)鹽酸來干燥。樣品中的氨基酸用OPA衍生，去除過量的OPA，用FMOC衍生亞胺酸(Pro和Hyp)， 并在HPLC反相柱上進(jìn)行多次稀釋。通過比較羥脯氨酸峰面積與以同樣的方法水解和衍生化的標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白制劑的 峰面積來確定膠原蛋白的含量。結(jié)果以每克濕羅非魚組織的毫克膠原蛋白表達(dá)。
同樣使用HPLC方法，低稀釋的反應(yīng)是非線性稀釋。在充分稀釋后，可以觀察到與稀釋有關(guān)的線性響應(yīng)。這些稀釋
液用于測(cè)定魚組織中的膠原蛋白。
用快速酶總膠原檢測(cè)發(fā)現(xiàn)每g濕羅非魚組織4.5mg膠原，與HPLC法發(fā)現(xiàn)的每g濕組織5.1mg膠原很一致。
結(jié)論
魚水解物含有干擾快速酶總膠原蛋白測(cè)定的因素，因?yàn)檫@是一個(gè)強(qiáng)非線性的 在低稀釋因子下觀察到與稀釋度的關(guān)系，無論是對(duì)魚的水解物本身和添加的羥脯氨酸。 當(dāng)稀釋16倍或更多時(shí)，魚類的反應(yīng)與稀釋度呈線性關(guān)系 水解物和加入羥脯氨酸 水解物和羥脯氨酸的平行線指向良好的回收率和相似 這兩個(gè)樣本的行為。 同樣，HPLC方法在低時(shí)觀察到響應(yīng)和稀釋之間的非線性關(guān)系 稀釋后，至少需要稀釋64倍。 建議在試點(diǎn)試驗(yàn)中確定一個(gè)特定物種的最佳稀釋度。數(shù)據(jù) 這里可以作為設(shè)計(jì)試點(diǎn)的指導(dǎo)。 快速酶總膠原分析非常適合于魚類組織中的膠原分析使用稀釋水解物。結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的HPLC方法具有良好的可比性。
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