如何測量小鼠組織中的膠原蛋白？

介紹
膠原蛋白是脊椎動物體內(nèi)豐富的蛋白質(zhì)。膠原蛋白的準確分析對于膠原蛋白發(fā)揮重要作用的疾病研究以及純化膠原蛋白在生物醫(yī)學、化妝品或營養(yǎng)品行業(yè)的應用都很重要。
雖然膠原蛋白是人體的主要成分，但它是一種難以純化和定量的分子。這部分是由于膠原蛋白分子通過不同類型的
交聯(lián)，使膠原蛋白分子不溶，難以提取。
商用膠原蛋白分析的數(shù)量和類型有限。基于用天狼星紅沉淀膠原蛋白分子，存在一些可溶性膠原蛋白的檢測方法。然而，這種方法似乎不太適用于組織中膠原蛋白的分析。*泛使用的膠原蛋白分析是基于膠原蛋白水解為游離氨基酸，然后用HPLC或比色法測量膠原蛋白特異性羥脯安酸。然而，這些分析方法費時費力，需要特殊設備。為了克服這些缺點，我們最近開發(fā)了QuickZyme總膠原蛋白測定法，該法基于酸水解和比色檢測的相同成熟原理，但速度更快，無需特殊設備。
在本應用說明中，我們比較了不同的測定方法，以測定各種小鼠組織中膠原蛋白的能力。我們使用QuickZyme總膠原蛋白測定法（酸水解，羥脯安酸比色檢測）、HPLC“金標準"法（酸水解，羥脯安酸HPLC檢測）和QuickZyme可溶性膠原蛋白測定法（酸/胃蛋白mei提取，天狼星紅結合，比色檢測）。

方法
處死健康小鼠（C57Bl6，8-10周齡），分離以下組織：肺、肝、腎、脾、心和真皮。此外，我們還以牛肌腱為樣本。將組織/器官分為三部分，其中一部分用于濕重測定、干重測定（在冷凍干燥組織后）、在6 M HCl中的酸水解（10 mg濕組織/100µl 6M HCl，最小體積為200µl）以及通過HPLC或使用比色QuickZyme總膠原蛋白測定法定量羥脯安酸。另一部分直接用于濕重測定，然后使用QuickZyme總膠原蛋白測定法進行酸水解和羥脯安酸定量。第三部分用于濕重測定，用0.5 M醋酸/胃蛋白每過夜培養(yǎng)提取膠原蛋白，然后離心，并使用天狼星紅可溶性膠原蛋白測定法進行定量。各種化驗的化驗原理見圖1。

圖1：。可溶性膠原蛋白測定法（左）、HPLC法總膠原蛋白測定法（中）和比色法總膠原蛋白測定法（右）的測定原理

后果
-通過酸水解，然后通過HPLC或QuickZyme比色法對膠原蛋白進行定量，兩者之間的相關性非常好，并產(chǎn)生類似的值

圖1：HPLC和羥脯安酸比色分析的比較。數(shù)值表示µg膠原蛋白/mg濕組織

水解可以用濕組織進行，也可以用干組織進行，結果相似。

圖2：濕組織和干組織中羥脯安酸分析的比較。數(shù)值表示µg膠原蛋白/mg組織

-用基于天狼星紅的可溶性膠原蛋白分析法分析各種組織中的可溶性膠原蛋白，得出了不同的結果，其值遠低于總膠原蛋白的值，許多組織甚至接近檢測極限。與QuickZyme總膠原蛋白測定法相比，可溶性膠原蛋白分析法測得的總膠原蛋白水平要低得多，例如肺2.5%，腎10%，脾8%，真皮9%，肌腱3%。低值可能是由于從大多數(shù)組織中提取的成熟膠原蛋白不足。
-用不同方法測量的各種組織中的膠原蛋白含量如表1所示。很明顯，每個器官的膠原蛋白水平各不相同，肌腱的膠原蛋白含量最高，其次是皮膚、肺、脾、腎、心臟和肝臟。

表1 通過酸水解，然后通過HPLC或QuickZyme比色分析，分析各種組織中膠原蛋白的近似量（每毫克濕重組織中含有µg膠原蛋白）。

-組織在6 M HCl（最小體積HCl 200µl）中以100 mg/ml（濕重，濕重/干重比見表3）水解，水解產(chǎn)物用4M HCl稀釋，如表2所示，35µl稀釋水解產(chǎn)物用于總膠原蛋白分析（根據(jù)分析手冊中的方案）。如表2所示，使用QuickZyme總膠原蛋白分析的最佳稀釋因子因組織而異。確定該稀釋系數(shù)時，應確保不存在基質(zhì)效應（如果樣品稀釋不足，則會發(fā)生），且該值符合標準線的范圍。

-各種組織的濕重與干重之比介于5.0（肺）和3.5（肌腱和皮膚）之間。濕組織或干組織中的膠原蛋白分析得出了類似的結果（數(shù)據(jù)未顯示）。
-在肝組織水解物中，由于稀釋程度較低的樣品中出現(xiàn)基質(zhì)效應，稀釋因子為5-10。這導致OD值較低（接近或低于標準線中的低濃度）。因此，對于這種類型的組織，我們開發(fā)了一種改良的膠原蛋白分析方法，在該方法中未觀察到基質(zhì)效應，因此不需要稀釋水解物（見第7頁的說明，QuickZyme敏感組織膠原蛋白分析）。

 結論
•每個組織的膠原蛋白含量不同：肌腱>皮膚>肺>腎>脾>心臟>肝臟
•基于天狼星紅的膠原蛋白分析不太適合組織中的膠原蛋白分析，可能是因為從組織中提取的膠原蛋白有限
•定量組織中膠原蛋白的最佳方法是充分水解組織，然后通過HPLC或比色法分析羥脯氨酸
•QuickZyme總膠原蛋白分析非常適合組織中的膠原蛋白分析，結果與HPLC相似，但快速、簡單，不需要特殊設備。
•對于膠原蛋白含量低、基質(zhì)效應大的組織樣品，我們開發(fā)了QuickZyme敏感組織膠原蛋白分析。

QuickZyme Biosciences已開發(fā)了一系列用于分析任何物種膠原蛋白的分析方法，每種方法都有不同的應用領域
QuickZyme Biosciences提供膠原蛋白分析：
•QuickZyme可溶性膠原蛋白分析
•QuickZyme總膠原蛋白測定
•QuickZyme羥脯安酸測定
•QuickZyme敏感組織膠原蛋白分析
•QuickZyme敏感組織羥脯安酸測定

QuickZyme可溶性膠原蛋白測定
該分析可識別可溶性或（酸/胃蛋白每）可溶性膠原蛋白。該分析為比色法，采用96孔板格式，基于膠原與天狼星紅（一種含磺酸基的陰離子染料）的沉淀。這種染料可以結合堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈。染料在高pH下從沉淀的絡合物中釋放，然后進行比色檢測。該分析經(jīng)過優(yōu)化，以使其他蛋白質(zhì)（如白蛋白）不會干擾。明膠（未折疊的膠原蛋白）不被該分析所識別。
應用：該方法用于測定細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基中的可溶性膠原蛋白和細胞提取物中的可溶性膠原蛋白（酸或酸/胃蛋白每）。由于組織中成熟膠原蛋白的提取效率非常低，因此該方法不太適合測量組織提取物中的膠原蛋白。
QuickZyme總膠原蛋白測定
該分析可識別所有類型的膠原，無論其形式如何（成熟、未成熟、前膠原、降解膠原、交聯(lián)膠原、各種來源的膠原）。
該分析為比色法，采用96孔板格式，并基于羥脯安酸的定量，羥脯氨酸是一種僅存在于膠原蛋白中的氨基酸。含膠原蛋白樣品經(jīng)酸水解后，羥脯安酸從膠原蛋白中釋放出來。水解在950C下進行，產(chǎn)品可直接用于羥脯安酸分析，無需洗滌或干燥步驟。該分析基于已建立的氯胺T/DMBA方法。
用途：該方法用于測定總膠原蛋白。這包括所有膠原類型和形式，例如：前膠原、未折疊膠原、成熟膠原以及樣品中所有膠原類型的膠原降解產(chǎn)物。由于第一步是樣品的*水解，提取膠原蛋白的困難不起作用。該分析適用于各種類型的樣品，包括組織。

QuickZyme敏感組織膠原測定
用羥脯安酸比色法測定組織樣本中的膠原蛋白時，一個常見的并發(fā)癥是出現(xiàn)所謂的基質(zhì)效應，這是由樣本中未識別的成分引起的。矩陣效應可能導致錯誤的高值或低值。可以通過稀釋樣品來防止基質(zhì)效應。然而，這種稀釋會導致樣品的有效靈敏度較低，這對于小型
膠原蛋白含量低的樣品。
與其他基于羥脯氨酸的分析相比，QuickZyme敏感組織膠原蛋白分析沒有基質(zhì)效應，也不需要稀釋水解物，從而能夠在低膠原蛋白濃度的小樣本中進行測量。該方法簡單，不需要酸水解后的干燥步驟，通常需要特殊設備。
應用：該方法用于測量組織樣本中的膠原蛋白，尤其是低膠原蛋白含量的組織，如肝臟。
QuickZyme羥脯安酸測定
該測定方法與總膠原蛋白測定方法相似，不同之處在于沒有膠原蛋白水解的方案和材料，也沒有膠原蛋白標準，但提供了羥脯安酸標準。
應用：該分析與總膠原蛋白分析具有相同的應用領域，但適用于有自己的水解方法或收集水解樣品進行分析的客戶。
QuickZyme敏感組織羥脯安酸測定
該測定方法與敏感組織膠原蛋白測定方法相似，不同之處在于沒有膠原蛋白水解的方案和材料，也沒有膠原蛋白標準，但提供了羥脯安酸標準。
應用：該分析與敏感組織膠原蛋白分析具有相同的應用領域，但適用于有自己水解方法或收集水解樣品進行分析的客戶。