immunoprecise MQ 17.101-96說(shuō)明書(shū)

roduct Name

Antibody Based Assay for PAD activity (ABAP)

 基于抗體的PAD活性試驗(yàn)(ABAP)

CAT No.

MQ 17.101-96

Quantity

96 well test

免責(zé)聲明

該試劑盒僅供研發(fā)使用。不得用于診斷或治療程序。

在研究領(lǐng)域外使用需要ImmunoPrecise Antibodies的許可證。

產(chǎn)品描述

基于抗體的PAD活性試驗(yàn)(ABAP)是一種用于測(cè)定細(xì)胞和組織裂解物中PAD酶活性的固體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。此外，其可與重組PAD酶聯(lián)合用于PAD抑制試驗(yàn)。將含精氨酸的肽包被在96孔板的條帶上。在每個(gè)試劑條上，用含脫亞胺精氨酸的肽包被孔H，作為陽(yáng)性對(duì)照。在與重組PAD酶或含有PAD酶的細(xì)胞/組織裂解物孵育期間，精氨酸是  被  去亞胺化的。  用含PAD的溶液孵育后，清洗過(guò)量的酶  離開(kāi)  和  a  單克隆  向孔中加入去亞胺精氨酸特異性檢測(cè)抗體。孵育后，洗滌孔并用HRP標(biāo)記的多克隆抗小鼠免疫球蛋白抗體孵育。

使用HRP底物顯色微孔板可產(chǎn)生與已脫亞胺精氨酸量成正比的染色反應(yīng)。在酶標(biāo)儀中測(cè)定的光密度可直接與試驗(yàn)中存在的對(duì)照酶的酶活性相關(guān)，從而定量PAD酶活性。

使用重組人PAD4驗(yàn)證ABAP  （圖1）和多種PAD表達(dá)組織的小鼠組織裂解物（圖2）。

試劑

• ABAP 96孔板。每個(gè)試劑條的孔H用含脫亞胺精氨酸的肽包被，作為ABAP試驗(yàn)中的陽(yáng)性對(duì)照。所有其他孔均用含精氨酸的肽包被。

· 用于活性校準(zhǔn)的人PAD酶（從細(xì)菌細(xì)胞裂解物中純化人PAD酶）。

· 含有疊氮化納作為防腐劑的脫亞胺緩沖液。

• 小鼠抗脫亞胺精氨酸。特異性結(jié)合脫亞胺精氨酸的專(zhuān)有ModiQuest Research小鼠單克隆抗體。

· HRP標(biāo)記的抗小鼠Ig抗體。

需要但未提供的試劑和設(shè)備

• 如果使用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作為底物，則多孔酶標(biāo)儀能夠在450 nm處讀數(shù)。如果使用不同的底物，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整波長(zhǎng)。

· 經(jīng)校準(zhǔn)的可調(diào)節(jié)精密移液器，用于5倍體積

μl和1000μl。

· 洗板機(jī)（選配）或歧管分配器。

· 加濕室。

· 各種尺寸的經(jīng)校準(zhǔn)燒杯和量筒。

· 渦旋混合器。

· 清洗緩沖液（PBS + 0.05%吐溫20）。

· 牛血清白蛋白(BSA)。

· 穩(wěn)定顯色劑(TMB)。

· 2M H2SO4（終止液）。

注意事項(xiàng)

1. 專(zhuān)業(yè)用戶。

2. 與任何生物來(lái)源的產(chǎn)品一樣，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)奶幚沓绦颉?/span>

• 該產(chǎn)品可與不同的樣本類(lèi)型和材料配合使用，因此各個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)所采用的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。

儲(chǔ)存/穩(wěn)定性

· 人PAD酶

Store at -80 ℃下儲(chǔ)存。使用后，立即在-80 ℃下重新冷凍。

避免反復(fù)凍融循環(huán)。將酶一直置于冰上。

· ABAP 96孔板

Store at -20 ℃下儲(chǔ)存。

避免反復(fù)凍融循環(huán)。

· 小鼠抗脫亞胺精氨酸

在-20 ℃下儲(chǔ)存。*使用后，在4 ℃下儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

· HRP標(biāo)記的抗小鼠Ig

在-20 ℃下儲(chǔ)存。*使用后，在4 ℃下儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

· 脫亞胺緩沖液

Store at -20 ℃下儲(chǔ)存。

 的制備

打開(kāi)前，在4 ℃下旋轉(zhuǎn)含有MQR人PAD酶的小瓶。對(duì)于活性校準(zhǔn)，PAD酶應(yīng)在脫亞胺緩沖液(40 mM Tris-HCl pH 7.5；5 mM CaCl2；1 mM DTT)中以適當(dāng)濃度（例如，從2.0至0.002 mU）稀釋?zhuān)糜诨钚郧€。

每孔100µl脫亞胺緩沖液中2.0 mU PAD可產(chǎn)生大脫亞胺，而 < 0.002 mU PAD/孔無(wú)可檢測(cè)活性。

程序

• 用100µl脫亞胺緩沖液在37 ℃下預(yù)孵育96孔板30 min。該步驟是平衡ABAP板所必需的。
• 倒置倒空ABAP板，置于冰上。此外，將脫亞胺緩沖液置于冰上。
• 在冰冷的脫亞胺緩沖液中稀釋需要檢測(cè)PAD活性的組織裂解物。使用PAD活性校準(zhǔn)樣本進(jìn)行相同操作。每孔應(yīng)加的總體積為100 μL（建議檢測(cè)不同濃度的裂解液。通常100 μL脫亞胺緩沖液中1 μL組織裂解液就足夠了）
• 將所有樣品加入ABAP板中，同時(shí)將所有樣品置于冰上。
• 在37 ℃的加濕室中孵育ABAP板1小時(shí)15 min。

6. 用清洗緩沖液清洗微孔板5次。

• 用清洗緩沖液 + 1%BSA以1:1000稀釋MQR小鼠抗脫亞胺精氨酸抗體。每孔加入100 μL抗體溶液。
• 在37 ℃的加濕室中孵育ABAP板1小時(shí)。

9. 用清洗緩沖液清洗微孔板5次。

• 用洗滌緩沖液 + 1%BSA以1:2000稀釋HRP標(biāo)記的抗小鼠Ig抗體。每孔加入100 μL抗體溶液。
• 在37 ℃的加濕室中孵育ABAP板1小時(shí)。

12. 用清洗緩沖液清洗微孔板5次。

13. 用不含吐溫-20的清洗緩沖液清洗微孔板3次。

• 向各孔中加入50µl TMB底物，并使其呈藍(lán)色（室溫下避光）。

請(qǐng)注意：可實(shí)現(xiàn)快速開(kāi)發(fā)。

• 向各孔中加入50µl 2M H2SO4以終止反應(yīng)。藍(lán)色將變?yōu)辄S色。

16. 在多孔酶標(biāo)儀中讀取450 nm處的OD。

圖1：向包被含精氨酸肽的ABAP板中加入越來(lái)越多的重組人PAD酶，導(dǎo)致檢測(cè)到越來(lái)越多的含瓜氨酸肽。加入EDTA通過(guò)捕獲鈣離子消除PAD活性。

圖2：不同小鼠組織樣本中PAD活性的檢測(cè)。在含鈣(-EDTA)或去鈣(+ EDTA)對(duì)照反應(yīng)中使用1μl組織裂解物，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)ABAP程序監(jiān)測(cè)PAD活性。將組織裂解物PAD活性歸一化為大重組人PAD活性(-EDTA)，并抑制人PAD(+ EDTA)。請(qǐng)注意：這是一張顯示ABAP測(cè)定能力的代表性圖片。