PANAGENE FISH（熒光原位雜交）PNA 端粒探針方案

PANAGENE F1001

原則上，熒光原位雜交 (FISH) 應(yīng)該能夠提供單個染色體端粒長度的信息。直接標(biāo)記的寡核苷酸探針由于其體積小（良好的穿透特性）、單鏈性質(zhì)（探針無變性）和受控的合成，是此類分析的有吸引力的探針。然而，端粒重復(fù)序列的寡核苷酸雜交的效率還不足以將這種方法擴(kuò)展到各種物種染色體中 TTAGGG 重復(fù)序列的定性研究之外。近研究表明，肽核酸 (PNA) 寡核苷酸探針將與互補(bǔ)的寡核苷酸序列雜交，產(chǎn)生的雙鏈比 DNA/DNA 或 DNA/RNA 雙鏈更穩(wěn)定。在 PNA 中，傳統(tǒng) DNA 和 RNA 寡核苷酸的帶電磷酸-（脫氧）核糖骨架被通過肽鍵連接的重復(fù) N-（2-氨基乙基）-甘氨酸單元的不帶電骨架取代。與 DNA 寡核苷酸相比，PNA 寡聚體表現(xiàn)出更高的序列特異性、改善的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和更低的背景。由于 PNA/DNA 雙鏈的 Tm 較高，短（18 聚體）端粒 PNA (CCCTAA)3 應(yīng)用廣泛。

開始前要做的事情二、雜交

1. 將載玻片置于 80 °C 預(yù)熱培養(yǎng)箱中 5 min。

I. 端粒 PNA 探針的制備

1. 打開試管前離心試管，以便在試管底部收集凍干 PNA 探針。

2. 向管中加入甲酰胺，得到 PNA 探針的儲備液。

3. 在 PNA 雜交緩沖液中將貯備液稀釋至終濃度 200 nM。

ü 注：將 PNA 探針溶液在 4 ℃ 下避光儲存。

II. 溶液制備

1. 雜交緩沖液

20 mM 鈉2HPO4, pH 7.4

20 mM Tris，pH 7.4

60% 甲酰胺 2X SSC

0.1µg/ml 鮭魚精子 DNA

2. RNase A 溶液

100µg/ml RNase A（2X SSC 中）

3. 胃蛋白酶 0.005% 溶液

50µl 5% 胃蛋白酶貯備液溶于 50 mL 0.01 MHCl 中。

ü 注：新鮮！使用前加熱至 45 ℃。

4. 洗滌液

2X SSC/0.1% 吐溫-20

雜交和洗滌

I. 預(yù)處理

1. 按照特定細(xì)胞系推薦的程序制備載玻片，并風(fēng)干。

2. 將載玻片在 PBS 中浸泡 15 min。

3. 將載玻片在 4% 甲醛的 PBS 中 37 °C 固定 4 min。

4. 37 °C PBS 洗 5 min (X2)。

5. 向一個干凈的平板中加入 500µl RNase A 溶液，并將每個載玻片面朝下置于 RNase A 溶液上，在 37 ℃ 下孵育 1 h。

ü 注：注意不要干燥。

6. 在 2X SSC（X3 重復(fù)）中清洗，并在 DW 中清洗。

7. 在 37 °C 下，將載玻片在 0.005% 胃蛋白酶中浸泡 4 min。

8. 37 °C PBS 洗 3 min (X2)。

9. 重復(fù)步驟 3-4。

10. 室溫下在 PBS 中清洗 5 min。

11. 在冷乙醇系列中脫水載玻片（在 70%、85%、100% 中脫水 1 min）。

12. 晾干載玻片。

2. 向每張載玻片的標(biāo)記區(qū)域加入 20µl PNA 探針的雜交緩沖液。

ü 注：使用前 90 °C 加熱雜交緩沖液 5 min。

3. 用 18 x 18 mm 蓋玻片覆蓋載玻片上的標(biāo)記區(qū)域。

ü 注：注意不要干燥。

4. 將載玻片在 85 °C 下變性 10 min。

ü 注：變性應(yīng)在低 80 ℃ 和高 90 ℃ 之間進(jìn)行。

仔細(xì)檢查培養(yǎng)箱的溫度。75 °C 以下的變性溫度嚴(yán)重?fù)p害結(jié)果。

5. 將載玻片在室溫下避光放置 1 h。

III. 洗滌

1. 在室溫下將載玻片浸入洗滌液中，以取出蓋玻片。

2. 在 55‐60 °C 下用清洗液清洗載玻片 10 min (X2)。

ü 注：應(yīng)在 55-60 ℃ 下進(jìn)行清洗。

3. 將載玻片在清洗液中清洗 1 min

室溫。

IV. 復(fù)染

1. 將載玻片在 DAPI/2X SSC 中染色 10 min。

2. 在 2X SSC 中清洗載玻片 2 min。

3. 在 1X SSC 中清洗載玻片 2 min。

4. 在 DW 中清洗載玻片 2 min。

5. 用離心機(jī)干燥載玻片。

6. 在載玻片的目標(biāo)區(qū)域滴一滴封片劑。

7. 蓋上蓋玻片，使溶液均勻分布在蓋玻片下。避免產(chǎn)生氣泡。

8. 使用帶有適當(dāng)濾光片的熒光顯微鏡觀察染色載玻片。

V. 參考文獻(xiàn)

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