ProMap® 初始 CFSE T 細胞增殖檢測說明書
繪制幼稚 T 細胞反應(yīng)的金標準
ProImmune 的 ProMap® T 細胞增殖測定可用于鑒定引發(fā)輔助 T 細胞增殖并因此可能引起輔助 T 細胞免疫反應(yīng)的表位序列。
與基于放射性胸苷摻入的傳統(tǒng)測定不同，該測定利用強大的流式細胞術(shù)方法，能夠準確測定增殖細胞的百分比和 T 細胞反應(yīng)的詳細表型，所有這些都顯著提高了整體靈敏度。
為什么選擇 ProMap® CFSE 增殖檢測？CFSE 染料稀釋是一種久經(jīng)考驗的方法，已在數(shù)千份出版物中引用 比放射性檢測靈敏得多 流式細胞儀讀數(shù)可解析要分析的正確細胞群，例如活 CD4+ T 細胞 進一步的子集表型易于添加，并且可以同時讀出子集的增殖 整體分析測量增殖時間范圍內(nèi)的所有增殖，而不是在孵育時間結(jié)束時的時間窗口內(nèi) |
主要出版物：
使用英國國防部 (MoD) 的一部分 [dstl] 發(fā)布的 ProMap® T 細胞分析驗證抗體人源化
圖 1比較了抗體的小鼠和人源化 V 區(qū)中重疊肽 T 細胞的反應(yīng)。
O'Brien LM、Goodchild SA、Phillpotts RJ、Perkins SD。
病毒學(xué) (2012) 426(2):100-5。[PMID:22341308]
英國政府國防科學(xué)與技術(shù)實驗室 [dstl] 的科學(xué)家使用 ProImmune 的 T 細胞增殖試驗來驗證他們的抗委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒 (VEEV) 抗體的人源化。序列人源化是將抗體中的動物蛋白序列替換為人源蛋白序列的合理設(shè)計方法。然而，這種方法并不能保證得到的生物制品具有低免疫原性。通過使用序列掃描 體外 T 細胞測定，可以生成抗原性數(shù)據(jù)以顯示嵌合序列和人源化序列之間的差異。 在此處閱讀完整的案例研究。
ProMap® T 細胞檢測和肽/蛋白質(zhì)療法
ProMap® T 細胞增殖測定已開發(fā)用于識別潛在 T 細胞表位的存在或不存在，可用于新肽或蛋白質(zhì)的臨床前發(fā)現(xiàn)。這些分析可以解決結(jié)構(gòu)相似分子之間的“相對免疫原性"問題；例如，它們可以幫助區(qū)分不同的候選者，或者可以表明蛋白質(zhì)工程策略在潛在免疫治療的去免疫中的成功。
作為 ProImmune 的 REVEAL® 免疫原性系統(tǒng)的一部分， ProMap® T 細胞增殖試驗的結(jié)果可以與 50 多個 II 類 HLA 等位基因的無細胞 HLA 肽結(jié)合試驗的結(jié)果一起分析。這為客戶提供了對一種或多種藥物先導(dǎo)的輔助 T 細胞免疫反應(yīng)的詳細資料。
| 圖 2： ProMap® T 細胞增殖檢測原理。 用于 20-50 個 HLA 型供體的 PBMC 選自 ProImmune 生物庫 根據(jù)項目要求合成肽庫 供體 PBMC 用 CFSE 染料標記。 每個肽與來自每個供體的 PBMC 共培養(yǎng)。 CD4+ T 細胞響應(yīng)肽的增殖導(dǎo)致 CFSE 標記的稀釋。 CFSE 的流式細胞術(shù)分析與 CD4 染色相結(jié)合，用于定量細胞分裂，并提供抗原性的測量。
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在我們的 Mastering Immunity 2020 會議的這段短片中，Tim Hickling 博士（羅氏免疫安全負責人）描述了如何將 ProMap ® T 細胞增殖檢測應(yīng)用于生物治療藥物的去免疫。
ProMap® T 細胞增殖檢測詳細信息
細胞用熒光染料 5,6-羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯 (CFSE) 進行標記。那些響應(yīng)抗原而增殖的細胞顯示出 CFSE 熒光強度的降低，這可以通過流式細胞儀直接測量。由于這是一種流式細胞儀檢測，它可以準確地確定增殖 CD4+ 細胞的百分比，能夠?qū)?T 細胞反應(yīng)進行詳細的表型分析，并且比基于放射性胸苷摻入的傳統(tǒng)檢測更敏感。
ProImmune 提供兩種類型的 T 細胞增殖檢測：
用于肽表位作圖的 ProMap® T 細胞檢測
該測定法用于鑒定可引發(fā)輔助 CD4+ T 細胞增殖并因此可能導(dǎo)致輔助 T 細胞免疫反應(yīng)的肽表位序列，該反應(yīng)可能導(dǎo)致抗藥物抗體 (ADA) 反應(yīng)或其他不需要的免疫原性。該測定還可用于評估蛋白質(zhì)序列的有益免疫原性，例如用于免疫療法的表位發(fā)現(xiàn)。
在該測定旨在關(guān)注 CD4+ 輔助 T 細胞反應(yīng)的情況下，CD8+ T 細胞耗盡和 CFSE 標記的供體 PBMC 與 5uM 每種感興趣的肽一起在六個重復(fù)孔中培養(yǎng) 7 天。每個測定板包括一組未經(jīng)處理的對照孔。該測定還結(jié)合了參考抗原對照，包括已知 MHC II 類抗原的合成肽和兩種有效的全蛋白抗原。
圖 3： 來自初始 T 細胞試驗的染色數(shù)據(jù)示例，(1) CFSE 標記的 T 細胞在培養(yǎng)基中單獨培養(yǎng)（未刺激），(2) CFSE 標記的 T 細胞與目標抗原衍生的肽一起培養(yǎng)，(3) CFSE-用對照蛋白 (Tuberculin PPD) 培養(yǎng)的標記 T 細胞。
通過流式細胞儀分析確定細胞增殖。對于 ProMap® T 細胞測定，通過與未刺激樣品的結(jié)果進行比較，確定每個受刺激樣品的高于背景的刺激百分比。每個樣本中 CD4+ CFSE 暗淡種群的計數(shù)表示為總 CD4+ 種群的比例。六個重復(fù)值用于計算高于背景的刺激百分比（有抗原刺激的 CD4+ CFSE 暗細胞的比例，減去沒有抗原刺激的 CD4+ CFSE 暗細胞的比例）。
從一式六份的值計算平均值和平均值的標準誤差。如果高于背景的百分比刺激大于 0.5% 并且也大于高于背景的 2 倍標準誤差，則結(jié)果被認為是“陽性"，盡管數(shù)據(jù)也顯示了不太嚴格的閾值，以允許考慮小響應(yīng)。
為了允許比較肽， 計算響應(yīng)指數(shù) 。該指數(shù)基于將每種肽的反應(yīng)幅度（高于背景的刺激百分比）乘以每種肽的反應(yīng)供體數(shù)量（抗原性百分比）。
報告中提供的數(shù)據(jù)是：
圖 4： 使用 ProMap® T 細胞增殖測定法測量的抗原性百分比：一組 43 名供體用于測試來自兩種治療性單克隆抗體 Remicade 和 Humira 重鏈區(qū)的肽的潛在免疫原性。每個供體用不同的顏色表示。引起 2 個或更多供體反應(yīng)的肽被認為值得進一步研究。
圖 5： ProMap® T 細胞增殖試驗的反應(yīng)指數(shù)：來自與圖 3 相同試驗的數(shù)據(jù)——反應(yīng)指數(shù)指示了對測試肽反應(yīng)的幅度和數(shù)量。請注意，PPD 的響應(yīng)超出了該圖的范圍。
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