描述

更少的siRNA，更少的脫靶效應(yīng)

一些出版物表明，轉(zhuǎn)染低濃度的 siRNA 可避免脫靶效應(yīng)。事實(shí)上，當(dāng)以高濃度轉(zhuǎn)染 siRNA 時(shí)，會(huì)觀察到這些不需要的非特異性副作用 (1,2)。因此，可以通過使用盡可能少的 siRNA 來提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。這就是 INTERFERin ^®專門設(shè)計(jì)用于使用低 siRNA 濃度提供高沉默效率的原因。
INTERFERin ^®介導(dǎo)的 1 nM 特定 siRNA 遞送顯示出選擇性和高效的基因表達(dá)敲低，而競爭對手 (L2K) 需要至少 10 nM siRNA 才能達(dá)到 50% 的沉默效率（圖 1）。

圖 1：INTERFERin ^®只需要 1 nM siRNA 即可實(shí)現(xiàn)有效的基因沉默。根據(jù)制造商的建議，使用 INTERFERin ^®或競爭產(chǎn)品 L2K用抗 Luc siRNA 轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶的 3LL 細(xì)胞。48 小時(shí)后使用常規(guī)測定法測量熒光素酶表達(dá)。對照siRNA未觀察到抑制作用。

令人驚訝的是，在 10 pM siRNA 下仍然實(shí)現(xiàn)了 50% 的沉默（圖 2）。

圖 2：即使在 siRNA 濃度極低的情況下，INTERFERin ^®也非常高效。A549-染GL3Luc細(xì)胞在血清的存在下與使用INTERFERin抗呂克的siRNA的遞減濃度轉(zhuǎn)染^®。48 小時(shí)后使用常規(guī)測定法測量熒光素酶表達(dá)。對照siRNA未觀察到抑制作用。

用 INTERFERin ^®轉(zhuǎn)染靶向內(nèi)源性核纖層蛋白 A/C 的 1 nM siRNA顯著降低了核纖層蛋白基因表達(dá)至幾乎檢測不到的水平（圖 3）。

圖 3：用 INTERFERin ^®轉(zhuǎn)染 1 nM siRNA導(dǎo)致高效和特異的基因沉默。使用 INTERFERin ^®用 1 nM lamin A/C siRNA 轉(zhuǎn)染 CaSki 細(xì)胞。48 小時(shí)后，通過免疫熒光顯微鏡確定核纖層蛋白 A/C 的沉默效率。

1. Birmingham, A. et al., (2006) Nature Methods, Vol.3, No3, 199-204 
2. Caffrey, D. et al., (2011) PLoS One。2011;6(7):e21503。電子版 2011 年 7 月 5 日。

適用于miRNA轉(zhuǎn)染

microRNA (miRNA) 寡核苷酸的轉(zhuǎn)染越來越多地用于分析特定 miRNA 對細(xì)胞功能的生物學(xué)影響。INTERFERin ^®是遞送miRNA、miRNA 模擬物或 pre-miRNA的試劑。
INTERFERin ^®是最新一代的siRNA & miRNA 轉(zhuǎn)染試劑，專為在多種細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率而設(shè)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)高基因沉默或刺激基因表達(dá)。事實(shí)上，還已知一些 miRNA 通過與感興趣基因的啟動(dòng)子結(jié)合來誘導(dǎo)基因表達(dá)。例如，INTERFERin ^®介導(dǎo)的 miR-373 遞送導(dǎo)致 E-鈣粘蛋白表達(dá)增加 3 倍（圖 4）。

圖 4：用 INTERFERin ^®轉(zhuǎn)染 miR-373增強(qiáng)了 E-鈣粘蛋白的表達(dá)。將 PC-3 細(xì)胞接種在 6 孔板中并使用 miR-373 (25 nM) 轉(zhuǎn)染，每孔使用 8 µl INTERFERin ^®。轉(zhuǎn)染后 72 小時(shí)，通過 RT-qPCR 測定 E-cadherin mRNA 表達(dá)水平。該測定用HPRT-1基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。

INTERFERin ^®的陽離子成分只需要很少量的寡核苷酸，因此轉(zhuǎn)染過程溫和。此外，簡單而強(qiáng)大的協(xié)議確保了可重復(fù)的結(jié)果。可以用少量的 INTERFERin ^®轉(zhuǎn)染像 miRNA 這樣的寡核苷酸，導(dǎo)致強(qiáng)烈的基因沉默或基因表達(dá)的刺激。無論使用何種濃度的 INTERFERin ^®，其效果大致相同，使 INTERFERin ^®成為一種經(jīng)濟(jì)的試劑。例如，使用不同體積的 INTERFERin ^®的倍數(shù)變化始終在 1.5 和 1.8 之間（圖 5）。

圖 5：INTERFERin ^®已經(jīng)在非常低的用量下有效。PC-3 細(xì)胞接種在 6 孔板中，并使用 miR-373 (10 nM) 轉(zhuǎn)染，每孔使用 4、6 或 8 µl INTERFERin ^®。轉(zhuǎn)染后 72 小時(shí)，通過蛋白質(zhì)印跡分析 E-鈣粘蛋白表達(dá)。使用β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)對測定進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。量化以控制情況為參考表示。

與高細(xì)胞活力相關(guān)的高轉(zhuǎn)染效率使 INTERFERin ^® 成為為科學(xué)出版物生成相關(guān)數(shù)據(jù)的試劑。事實(shí)上， 自推出以來，使用 INTERFERin ^®研究 miRNA 和 miRNA 相關(guān)分子的出版物數(shù)量呈指數(shù)增長（圖 6）。

圖 6：INTERFERin ^®參與了越來越多關(guān)于 miRNA 轉(zhuǎn)染的出版物。

超過 90% 的基因沉默

對于許多貼壁細(xì)胞系或原代細(xì)胞，1 nM siRNA 足以獲得 90% 以上的基因沉默。對于懸浮細(xì)胞系，使用 5 nM siRNA的 INTERFERin ^®仍然可以達(dá)到 80% 的沉默（表 1）。

表 1：成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系和使用 INTERFERin ^®獲得的沉默效率。

我們的Polyplus 轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)庫中提供了各種細(xì)胞系的特定條件。

出色的細(xì)胞活力

在細(xì)胞活力方面，INTERFERin ^®優(yōu)于其他轉(zhuǎn)染試劑。用 1 nM siRNA 轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)后，用 INTERFERin ^®轉(zhuǎn)染的細(xì)胞看起來很健康，而用試劑 S 可以清楚地觀察到毒性（圖 7）。

圖 7：INTERFERin ^®對細(xì)胞非常溫和，如使用 INTERFERin ^®或競爭試劑轉(zhuǎn)染 siRNA 48 小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)比較所示。A549-GL3Luc 細(xì)胞在血清存在下使用 INTERFERin ^®或競爭者 S 或 H 根據(jù)制造商的方案用 1 nM 熒光素酶 siRNA 轉(zhuǎn)染。

簡單的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議

INTERFERin ^®可以立即使用，并且協(xié)議簡單明了。1 nM siRNA 的起始濃度可確保大多數(shù)細(xì)胞類型中的大多數(shù)基因沉默（圖 8）。
INTERFERin ^®是與血清和抗生素兼容，因此避免任何耗時(shí)洗滌和介質(zhì)變化; 此外，INTERFERin ^®可以留在細(xì)胞上而不會(huì)產(chǎn)生任何不利影響。

圖 8：INTERFERin ^®協(xié)議